Séquençage du SARS-CoV-2 par la technologie nanopore
Jeudi 1er juillet 2021
9h30 – 11h00
Programme
– Protocoles SARS-CoV-2 ARTIC Nanopore, détails, points clés et options.
Barbara Ottolini. Scientifique support technique ONT
– Analyses bio-informatiques des résultats de séquençage SARS-CoV-2
Barbara Ottolini. Scientifique support technique ONT
– Retour opérationnel en contexte hospitalier – organisation du laboratoire
Benoit Visseaux. Praticien Hospitalier hopital Bichat
– Retour opérationnel en contexte hospitalier – analyses bioinformatiques
Antoine Bridier-Nahmias. Maitre de Conférence INSERM IAME
– Questions/réponses
Coordonnatrice : Sonia Burrel
MCU-PH Virologie, GHU Pitié-Salpêtrière Paris. CNR Herpèsvirus (laboratoire associé HSV). SU-INSERM UMR_S 1136 Team 3 THERAVIR IPLESP
pour la section Virologie
Questions/réponses
Quand on séquence des grands fragments (>10kb), est ce qu'on a une diminution de la précision de séquençage sur la fin de séquence?
Non !
C’est un énorme avantage comparé aux techniques de la génération précédente. La qualité du basecalling ne dépend pas de la position dans la séquence.
Barbara O. pourra sans doute préciser après son intervention.
Est ce qu'on peut faire du paired-end sur les proto classic et eco?
Cela n’est pas nécessaire pour Oxford Nanopore. Si vous souhaitez ameliorer un assemblage, Il est possible de sequencer en 1 seule molecule d’ADN ou d’ARN natif plusieurs centaines de kb (record 4MB). Il est egalement possible d’utiliser des longs ranges PCR et les sequencer en une fois ~4kbs
Nous avons principalement du variant gamma qui pose quelques défauts d'amplification à certaines positions en ARTIC V3. Nous avons rarement du 1000x pour tous les échantillons ! Quel est le seuil d'acceptation pour les échantillons présentant des profils entre 90-99% de couverture à 200x ?
200x c’est déjà très très bon. Le taux d’erreur du nanopore étant autour de 1% (dans notre expérience avec le protocole ARTIC), et puisque l’on travaille avec une séquence consensus, cela permet d’avoir la bonne séquence sans risque d’erreur.
Pour compléter, une nouvelle version du jeu d’amorce vient d’être mise à disposition pour combler les trous liées aux mutations des beta, delta et gamma.
Nous utilisons RAMPART pour le suivi, vous recommanderiez plutôt Epi2Me?
RAMPART est sans doute moins à jour mais si cela fonctionne pour vous de manière satisfaisante je pense que ce n’est pas un problème.
(Dernier commit RAMPART sur github en mai 2020.)
Bonjour Faut-il cocher "both end" sur le Gridion pour un run en protocole ECO?
Oui, l’ARTIC ECO fonctionne avec la chimie de ligation et vous pouvez sélectionner “barcode both ends”. Vous pouvez également essayer de relaxer les paramètres de démultiplexage en sélectionnant le code-barres à une seule extrémité pour voir combien de reads vous récupérez.
On peut commander les pools d'amorces V4 déjà établis? Ou c'est conseillé d'établir le pool nous même?
Vous trouverez les séquences d’amorces V4 ici :
https://community.artic.network/t/sars-cov-2-version-4-scheme-release/312
Nous pensons que NEB adaptera bientôt ses pools, mais en attendant, vous pouvez également commander les pools V4 en tant que produits personnalisés auprès de sociétés comme IDT.
Concernant les analyses bio-inforamtique avec epi2Me Labs nextflow. Avez-vous comparé epi2Me Labs (nextflow) et le pipeline nextflow nf-core viralrecon ?
Je crois que pour l’illumina il a plein de choses intéressantes mais que pour des reads nanopore il n’y aura pas de différence ou presque car ce sera le pipeline ARTIC qui sera mis à contribution de toute façon.
Je confirme ce que je disais plus haut, voici l’information tirée du github de viralrecon:
“Align reads, call variants and generate consensus sequence (artic minion)”
https://github.com/nf-core/viralrecon
Bonjour, Avez vous un recul sur l'études des doubles populations ? Merci
Oui. On l’a fait avec Antoine pour un cas de co-infection avec deux souches SARS-CoV-2. Une souche à grosso modo 35% et une autre à 65% (+/- 10% en fonction des tuiles). Quelques tuiles avec deux mutations sur le même amplicon ont permis de faire du linkage.
A moins de 500 pores, quel maximum d'échantillons pourrait-on passer ?
C’est très difficile à dire, car cela dépend du temps de fonctionnement qu’il vous reste. S’il vous reste plus de 24h, vous pouvez charger 48 échantillons et laisser tourner jusqu’à la fin.
Rajout de Benoit. Cela dépend aussi bcp de l’optimisation de vos protocoles en amonts et de l’expérience des techniciens. A 500 pores avec 24h devant vous, je vous conseillerais de ne pas aller trop haut pour commencer. Ce sont typiquement les puces que l’on va utiliser pour les mini séries de l’été 🙂
A propos du paramètre barcode "at both ends", lorsque activé on a énormément de reads unclassified (près de la moitié de chaque run), quasiment tous (>90%) récupérés si on le désactive. Vous recommandez de ne pas l'utiliser? Ne risque-t-on pas de réduire la fiabilité de nos séquences consensus?
A ce propos, pourriez-vous essayer d’effectuer un nouvel basecalling en sélectionnant l’option “override mid-read barcode” et en plaçant le seuil à 50 ?
Nous constatons que de nombreux utilisateurs utilisant le protocole Midnight (barcode one end) obtiennent des résultats extrêmement solides en termes de séquence consensus.
Une petite précision concernant la protéine motrice : Si votre librairie est dans le tampon d'élution avec la protéine motrice attachée, elle sera stable pendant de courtes périodes à +4°C et à -80°C pour un stockage à long terme.
Si au contraire la librairie est mise dans le tampon de séquençage avec les billes de chargement, elle doit être conservée sur glace et lancée dès que possible.
Vous pouvez trouver plus d’informations sur ce sujet à ce lien :
https://community.nanoporetech.com/knowledge/know-how/library-stability
Pour diminuer les coûts, sur la même flowcell vous pouvez lancer 48 échantillons en jour 1, laver la flowcell (wash) et lancer 48 nouveaux échantillons en jour 2. Voir faire 2 lavages Ex: 32 échantillons en jour 1 / wash / 32 échants jour 2 / wash / 32 échants jour 3
Donc pour le SARS-cov2 la limite est 96 échantillons par Flowcells (96 code-barres Nanopore disponibles) en un ou plusieurs lavages.
A quelle fréquence epi2me-labs est mis à jour ? Est-ce que epi2me-labs suit bien l'évolution du pipeline bioinfo. d'artic ?
Les mises à jour sont extrêmement fréquentes ! Hier justement, nous avons ajouté de nouveaux flux de travail et une série d’optimisations !
https://community.nanoporetech.com/posts/bioinformatics-updates-in
Complément de Benoit au passage : si GridION, il faut prévoir la connexion à internet. C’est un environnement linux et il faut batailler un peu avec les services informatiques. Dans l’intervalle, on a fait les mises à jour via une connexion 4G (faisable ++ mais peu pratique).
Bonjour, Si on prend en compte le cahier des charges du CNR, une couverture moyenne de 1000X est demandée dans le cadre du séquençage SARS-CoV-2. A ce que j'ai cru comprendre ici, ce n'est pas une valeur qui semble si facile à obtenir sur l'ensemble des échantillons. Est-ce la cas ?
Va être atteint pour une bonne partie des échantillons, mais pas tous. C’est un prérequis très adapté à illumina, moins à nanopore. Le pipeline Artic accepte bcp bcp moins et la qualité reste satisfaisante.
merci pour la réponse, je suis assez d'accord 🙂 attention au modèle medaka il y en a qui créent beaucoup de frameshifts que d'autres (pour info)
Oui c’est assez dur de les comparer mais ce serait intéressant.
